Enzymes · ⁨Ферменты⁩

Ферменты — это глобулярные белки — вид белка с округлой, растворимой формой. Они являются биологическими катализаторами: они катализируют (ускоряют) химические реакции в живых организмах и не расходуются, поэтому каждый фермент работает многократно.

Ферменты действуют в двух местах:

• внутриклеточные ферменты работают внутри клетки, которая их синтезировала. Пример — каталаза, которая расщепляет вредный перекись водорода.
• внеклеточные ферменты секретируются (выделяются наружу) для работы вне клетки. Пример — амилаза, которая выделяется в кишечник для пищеварения крахмала.

У каждой фермента есть специальное углубление, называемое активным центром. Молекула, на которую он воздействует, является его субстратом. Субстрат помещается в активный центр, образуя комплекс фермент–субстрат. Затем происходит реакция, и продукты покидают активный центр, освобождая его для следующего субстрата.

Специфичность

Фермент специфичен: обычно он действует только на один субстрат. Это происходит потому, что форма активного центра комплементарна (соответствует) форме именно этого субстрата и не подходит ни к какому другому. Мы называем это специфичностью.

Существуют две концепции, объясняющие, как субстрат помещается в активный центр:

• гипотеза «ключ-замок» — активный центр имеет фиксированную форму, и в него помещается только субстрат с соответствующей формой, как ключ в замке.
• гипотеза индуцированного соответствия — активный центр сначала не совсем подходит по форме. Когда субстрат связывается, активный центр немного меняет свою форму, чтобы плотно обхватить его. Эта идея лучше соответствует фактическим данным.

Снижение энергии активации

Каждой реакции требуется небольшой «толчок» энергии для начала, который называется энергия активации. Фермент снижает энергию активации. Это позволяет реакции протекать быстро при нормальной температуре клетки, без необходимости в высоком нагреве.

Вы можете отслеживать ферментативную реакцию двумя способами:

• измерять скорость образования продукта. С каталазой продуктом является кислород, поэтому вы собираете газ и измеряете его объем со временем.
• измерять скорость исчезновения субстрата. С амилазой вы отбирают пробы и используют йодный тест; сине-черная окраска бледнеет по мере расходования крахмала.

Колориметр делает это точно. Он пропускает свет через пробирку и измеряет поглощение света, так что изменение цвета превращается в числовое значение, которое можно построить на графике.

Скорость реакции наиболее крутая в начале (когда субстрата больше всего), поэтому начальная скорость (наклон касательной в момент времени ноль) является наиболее объективным значением для сравнения.

Решенный пример. За первые $20$ секунд реакции каталазы собирается $16\ \text{cm}^3$ кислорода. Оцените скорость реакции.

Поскольку реакция fastest в начале, измерение за этот короткий начальный интервал дает значение, близкое к начальной скорости; усреднение за более длительный период включало бы более медленные последующие этапы и занизило бы результат.

Температура

По мере повышения температуры молекулы приобретают больше кинетической энергии и сталкиваются чаще, поэтому скорость возрастает. Но выше оптимальной температуры фермент начинает денатурировать: тепло разрывает связи, удерживающие его форму, поэтому активный центр изменяется и больше не подходит к субстрату. Скорость затем резко падает.

pH

У каждого фермента есть оптимальный pH. Если pH слишком сильно смещается от него, фермент денатурирует, и скорость падает. Для справедливого изучения pH его поддерживают стабильным с помощью буферного раствора.

Концентрация фермента

При наличии избытка субстрата увеличение количества фермента означает больше активных центров, поэтому скорость возрастает пропорционально концентрации фермента.

Концентрация субстрата

Сначала добавление большего количества субстрата ускоряет реакцию. Но после того, как все активные центры заняты, добавление еще больше не имеет значения — скорость выходит на максимум.

Концентрация ингибитора

Ингибитор — это молекула, замедляющая работу фермента. Чем больше ингибитора присутствует, тем ниже скорость.

Скорость выхода на плато, когда все активные центры заполнены, является максимальной скоростью, обозначаемой как $V_{\text{max}}$.

Константа Михаэлиса–Ментен ($K_{\text{m}}$) — это концентрация субстрата, дающая половину от $V_{\text{max}}$. Она говорит о сродстве (притяжении) фермента к своему субстрату:

• низкое $K_{\text{m}}$ означает, что фермент достигает половины максимальной скорости при низкой концентрации субстрата, то есть обладает высоким сродством.
• высокое $K_{\text{m}}$ означает низкое сродство.

Таким образом, $K_{\text{m}}$ позволяет сравнивать, насколько сильно разные ферменты удерживают свои субстраты.

Некоторые ингибиторы являются обратимыми: они могут снова отсоединяться от фермента. Существует два типа.

Иммобилизованный фермент закреплен на месте — например, заключен внутри маленьких шариков альгината, вместо того чтобы плавать свободно в растворе. Раствор субстрата протекает мимо этих шариков.

Свободный фермент обычно работает немного быстрее, так как субстрат легко до него достает. Но иммобилизованные ферменты имеют большие практические преимущества:

• фермент не смывается, поэтому его можно использовать многократно.
• продукт получается чистым — он не смешан с ферментом.
• фермент более стабилен, поэтому лучше переносит изменения температуры и pH.
• процесс может протекать непрерывно: субстрат поступает, продукт выходит.

• Объяснить действие фермента по модели индуцированного соответствия (активный центр обволакивает субстрат) — сейчас предпочтительнее модели «ключ-замок».
• Выше оптимальной температуры фермент денатурирует (разрушаются водородные связи и третичная структура) — пишите «denatures», никогда не «dies» или «is killed».
• Различать ингибиторы: конкурентный связывается с активным центром (преодолевается избытком субстрата, тот же $V_{max}$); неконкурентный связывается в другом месте (снижает $V_{max}$).
• Сравнивать скорости по начальной скорости (касательная в момент времени ноль) — это наиболее объективная мера до того, как субстрат станет лимитирующим фактором.